流體剪切力實驗：流體環境下的HUVEC細胞培養，真實還原體內環境

這里我們以HUVEC細胞為例，使用ibidi流體剪切力系統進行一個流體條件下的細胞培養與靜置狀態下的細胞培養的對比實驗。

一.實驗準備實驗材料及設備

1. 細胞： HUVECs細胞系
2. 培養基：Endothelial Cell Growth Medium（PromoCell，Germany，C-22010）

           胎牛血清

1. 培養耗材：ibidi單通道載玻片μ-Slide I0.6 Luer （ibidi，Germany，80186）

             灌流管，15cm，1.6mm直徑（ibidi，Germany，10962）

             封口夾 

1. 儀器設備：ibidi流體剪切力系統，含空氣泵（ibidi，Germany，10905）和流體單元（ibidi，Germany，10903）

1. 實驗方法

在實驗開始前一天，請將所有需要使用的試劑，培養基，通道載玻片，灌流管都在37℃的二氧化碳培養箱中放置到第二天，排除由于溫度差產生的微量氣泡。

一.）培養細胞

準備HUVECs細胞系，按照常規細胞培養方法進行培養。好使用比較健康的內皮細胞，以防在做流體實驗時候細胞不能穩定貼壁。我們建議使用內皮細胞培養基+10%FCS培養HUVEC。好使用4代以內的HUVEC。已獲得較好的實驗結果。

按照下面流程鋪細胞：

1. 將150μl的1.6 x 106 cells/ml密度的細胞懸液加入通道載玻片中，注意，將移液器頭插入注液孔中再加入細胞懸液，可以輕微傾斜通道載玻片幫助細胞懸液充滿整個通道（圖一）。

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2.蓋上注液孔蓋，將通道載玻片放入細胞培養箱中培養半小時，等待細胞貼壁。細胞貼壁后，拿出通道載玻片，在每個注液孔中分別加入60μl培養基，注意，槍頭要懸在孔上方滴入培養基（圖二）

3.將通道載玻片再放入二氧化碳培養箱進行培養2-4小時左右，等到細胞剛剛長滿為單細胞層，即可開始實驗（圖三）。注意，要使用單層細胞進行剪切力實驗，使每個細胞均受到均勻的剪切力。

                                                                           圖三

3.靜置條件下細胞培養。在通道載玻片中靜置培養的細胞可以作為流體剪切力條件下培養的細胞對照。待流體實驗開始的同時，將靜置細胞培養的對照組放入二氧化碳培養箱中進行7天的培養。注意，培養過程中每天都要更換培養基。

二）搭建流體系統

1. 將灌流管按照說明放在置在流體單元上。在灌流管的儲液管中加入12ml培養基。這時不需要連接通道載玻片。實驗前需要去除整個灌流管中的氣泡，存留在灌流系統的氣泡會影響剪切力的大小，有時還會使灌流系統中的液體流動停滯。打開ibidi泵控制系統，在任務欄中找到“Remove air bubbles”，ibidi流體剪切力系統將自動運行下面任務，用于去除氣泡。（表一）

2.連接通道載玻片。去除氣泡后，就可以將之前準備好的含貼壁細胞的通道載玻片與灌流管相連。將搭載灌流管的流體單元從流體剪切力系統中取下，放到超凈臺中。將通道載玻片的注液孔用培養基裝至過滿狀態(?）。之后就按照下面的流程圖連接通道載玻片（圖四）。

圖四：a）封口夾輕輕將灌流管的硅膠管夾住。b）將其中一個魯爾接頭從中間的鏈接管中拔出。c-j）按圖示，將魯爾接頭與通道載玻片的注液孔相連，注意不能產生氣泡，會有部分培養基溢出。k）連接好后，將封口夾移除，用無塵紙將溢出的培養基擦除。l）全部連接好后，用顯微鏡觀測一下通道內的細胞狀態。

3）檢查灌流系統是否密封、是否將灌流管插入了正確的閥門。將封口夾夾住其中一根硅膠管，如果兩邊的灌流儲液管液面不會下降或者上升，那么，整個系統就是密封的，并且是正確安裝的（圖五）。

                                                       圖五。

4.開始流體剪切力實驗（單向層流）。將搭建好的流體單元與流體剪切力泵相連后，將整個流體單元放入二氧化碳培養箱中。打開控制軟件，設置實驗條件與步驟。為了使貼壁細胞適應剪切力培養環境。先用低剪切力刺激，逐步提高并且保持在一定的剪切力（表二）。

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三 ）實驗結果

一.形態對比
在培養7天之后，可以直接用顯微鏡觀察到細胞的形態發生了顯著的變化，在剪切力刺激下培養的細胞形態更加修長，排列更加緊密和規律。而靜置狀態下培養了7天的細胞形態沒有顯著的變化（圖六）。

圖六：如上所示，在20 dyn/cm2刺激下的細胞更為修長排列更加緊密。

1. 免疫熒光實驗

1. 去除通道內培養基。用1mlPBS沖洗通道，在注入PBS的同時，用槍頭從另一個注液孔吸出廢液。
2. 加入約200μl的3.7%多聚甲醛的PBS溶液，用槍頭從另一個注液孔吸出廢液。靜置10分鐘。
3. 按照步驟1）沖洗通道
4. 加入200μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分鐘
5. 按照步驟1）沖洗通道
6. 加入200μl 1% BSA的PBS溶液封閉20分鐘
7. 按照步驟1）沖洗通道
8. 依次加入一抗，二抗進行免疫熒光染色后，沖洗通道并加入封片液進行顯微鏡觀察（圖七、圖八）。

圖七：HUVEC細胞在20 dyn/cm2刺激7天的免疫熒光結果?？梢钥吹郊毎羌芘帕蟹较蚍浅Ｒ恢?。藍色：細胞核；綠色：VE- cadherins；紅色：actin filaments

圖八：靜置狀態下培養7天的HUVEC細胞，可以看見細胞骨架排雷沒有規律性，并且表達量也略少。

三.實驗總結
綜上所述，對于HUVEC細胞而言，流動剪切力的培養環境更為貼近其自然生長的環境，我們實驗說明在靜置狀態下并不能展現出HUVEC細胞的生理特性。